元アンブレラ社の特殊工作員で、本作の主人公。前作でラクーンシティ地下の極秘研究所ハイブを環境保護活動家のマット・アディソンとともに脱出した直後、アンブレラ社の研究員に拘束させられ、ラクーンシティ病院に運ばれた。T-ウイルスに汚染されたハイブから全くウイルスに感染することなく脱出を果たしたことから、アンブレラ社の科学部門のヘッドであるアイザックス博士から、アンブレラ社が計画する実験への適性を見込まれて、ラクーンシティ病院でT-ウイルスを投与され続けた。結果としてウイルスを細胞レベルで取り込み、肉体的な変異を伴わずに超人的な身体能力を得ることに成功した。逃げたヘリがアークレー山脈で墜落し負傷を受けてアンブレラ社に回収されるも回復してジルらに奪還されている。

前作でアリスと共にハイブの惨劇を生き残った人物。本作ではアリスの回想映像で登場する。ハイブ脱出後、研究員に拘束されてラクーンシティ病院へ運ばれて「ネメシス計画（Nemesis Program）」の実験台にされた。

ラクーンシティ警察の特殊部隊S.T.A.R.S.に所属する若き女性隊員。ラクーンシティで発行されている新聞に「S.T.A.R.S.の新星（S.T.A.R.S. Star）」と評されるほど、将来有望な若手隊員として、もてはやされていたが、物語開始前にラクーンシティ郊外のアークレイ山地で発生していた猟奇殺人事件の調査中に、アンデッドと交戦する事件に巻き込まれる。事件に巻き込まれる中で、猟奇殺人事件の犯人がアンデッドであることと、アンデッドを生み出した当事者が、世界有数の巨大民間企業であるアンブレラ社であることを掴んだものの、ラクーンシティ警察の署長であり、アンブレラ社から多額の資金援助を受けて設立された特殊部隊S.T.A.R.S.の隊長も務めるライアン・ヘンダーソンによって、事件の真相をもみ消されて、ジル本人は圧力を受けて無期限の自宅謹慎処分（停職）となってしまった。しかしラクーンシティで発生したバイオハザードによるアンデッドの出現を機に出動命令を受け、行動を開始する。本作における彼女の衣装は、原作ゲーム『3』におけるジルの私服姿を忠実に再現したものとなっている。さらにジル役を演じたシエンナ・ギロリーは、ジルを演じるにあたって、原作ゲーム内におけるジルの動きの癖や身振りを徹底的に研究しており、待機する際に腰に手を当てるしぐさや、ゲーム中の歩き方などが映画においても再現されている。

ラクーンシティ警察の特殊部隊S.T.A.R.S.に所属する黒人の男性隊員。ジルの上司かつ戦友であり、親交も深い。ラクーンシティの入り口の一つであるレイヴンズ・ゲート・ブリッジにて、アンブレラ社が実施していた検疫に協力し、町から脱出しようと押し寄せる市民たちを誘導していたが、心臓発作を起こして死亡した市民の一人がアンデッドへ転化し、足を噛みつかれてT-ウイルスに感染してしまう。T-ウイルスに感染して時間が経ちすぎてしまい、映画の中盤のラクーンシティ墓地にて、もう助からないと悟ったアリスによって銃を突きつけられるが、ジルによって阻止される。その後も生き延びていたが、最後はアリスの警告を無視して強引に道を進んだ結果、ネメシスに撃ち殺されてしまった。その後アンデッド化してジルに襲いかかるも、眉間を撃ち抜かれて完全に絶命する。本作には、ペイトンを含めて、原作ゲームには登場しないラクーンシティ警察の特殊部隊S.T.A.R.S.の映画オリジナルメンバーが数多く登場するが、これら全ての男性隊員の衣装は、原作ゲーム『1』におけるS.T.A.R.S.在籍時のクリス・レッドフィールドが着用するS.T.A.R.S.の制服を再現したものとなっている。

ラクーンシティ警察の特殊部隊S.T.A.R.S.の隊長兼ラクーンシティ警察の署長を務める中年男性。S.T.A.R.S.に多額の資金提供を行っているアンブレラ社の傀儡であり、物語開始前にラクーンシティ郊外のアークレイ山地で発生していた猟奇殺人事件が、アンブレラ社の生み出したアンデッドによるものであることを主張したジル・バレンタインを猟奇殺人事件の真相をもみ消した上で自宅謹慎処分とした。実際にアンデッドを目撃したことはなかったようで、ラクーンシティにアンデッドが出現し、映画冒頭のラクーンシティ警察署のシーンで初登場した際は、慌てていたところをジルから「頭を撃ち抜きなさい」とアドバイスを受けた。後に登場した際は、他のS.T.A.R.S.隊員と共に市内の建物の中に籠城し、逃げ込んできたL.J.を迎え入れるなどしていたが、直後に出現したネメシスによって殺害された。

ラクーンシティ警察署にスリの容疑で捕まっていた黒人男性。車で警官のゾンビを轢いて遊んでいた。ジルや生存者のS.T.A.R.S.隊員たちに助けられた後、アリスたちと共に行動する。

ラクーンシティのテレビ局で放送しているテレビ番組『ラクーン7』の女性ニュースキャスター。職業柄からか、精神安定の薬を大量に服用しており、キース・デカンディード著の本作の小説版や、約4分の追加映像を収録した本作のエクステンデッド・カット版では、ラクーンシティの墓地でそれをアリスに注意されて薬を処分される場面がある。ラクーンシティにアンデッドが現れた後は、町がアンデッドに襲われてパニックになる様子や、アンブレラ社が市外に脱出しようとする市民を非合法に銃撃する様子などをドキュメンタリーとして、小型カメラで撮影し続けている。本人曰く、これはラクーンシティで起きた真実を世界に向けて告発し、エミー賞を受賞するためとのこと。ラクーンシティから脱出するためにアリスらと行動を共にし、脱出の鍵を握るアンジェラを救うためにラクーンシティ小学校に向かったが、アンジェラを手分けして探すために単独行動していたところを生徒のアンデッドの集団に襲われて死亡する。彼女がラクーンシティで起きた出来事を撮影し続けていたカメラは、後にジルの手に渡り、アリスやジルたちが町から脱出した後に、アンブレラ社の告発資料として提出されたが、アンブレラ社の情報操作によってそれが捏造された映像であると処理されてしまい、ジルたちはデマ犯として指名手配されて、警察などから追われ続ける身になった。

ラクーンシティ小学校に通っているチャールズの一人娘で、愛称はアンジー。難病の筋ジストロフィーを患っていたが、チャールズの開発したT-ウイルスによって治癒した。ただし、ウイルスの変異を抑えるために定期的に抗ウイルスワクチンを接種している。アンブレラ社によってチャールズの元へ連行される途中に交通事故に巻き込まれて車が大破するも怪我もなく奇跡的に無事で、再び学校に隠れていたところをアリスたちに助けられる。

アンブレラ社が保有するバイオハザード対策部隊U.B.C.S.の隊長。仲間と共にラクーンシティへ派遣されたが、部隊が壊滅し、アンブレラにも見捨てられてしまったため、アンブレラを見限って脱出を目指す。南アメリカ出身で、尋常でない反動があるデザートイーグルを2丁同時に射撃できるほど身体能力は高い。原作のような軽い雰囲気はなく、また原作のカルロスより年配である。どちらかと言えば原作におけるクリスに近いキャラクターである。

U.B.C.S.の軍曹。カルロスの事実上の副官のような立場である。カルロスやユーリと共にラクーンシティからの脱出を目指す。ゾンビ化が始まったユーリを最後まで見捨てずに助けようとするなど非常に仲間想いでありカルロスからも相棒として信頼されているなど原作のニコライとは正反対のキャラクターである。ラクーンシティ小学校でジルとアンジェラに出会い彼女らを助けるもすぐに2体のゾンビ犬に襲われ死亡した。

U.B.C.S.の隊員。カルロスやニコライと行動を共にしていたが、アンデッドに噛まれてT-ウイルスに感染する。その後、アンデッド化してカルロスに噛み付くが、ニコライに射殺される。

アンブレラ社のラクーンシティ隔離部隊指揮官およびCSA少佐。ネメシス計画およびラクーンシティ消毒に使用する核ミサイル発射を任されている。冷酷な性格で、ラクーンシティの出口にまで感染者がいたのを知った瞬間から、非感染者関係なく銃を向けてラクーンシティに追いやって封鎖し、アリスがネメシスとの決闘を拒絶すると、チャールズを娘の目の前で平然と射殺した。後にアリスとネメシスが共闘を張った上、ジルやカルロスらの反撃に遭い、ヘリで脱出する際はアリスに「事態を打開するための第一歩」としてゾンビの集団の中に放り込まれる。落ちていた銃でゾンビに応戦したが、弾切れとなって自殺もできなくなった所へ、最期は自らが射殺した後、ゾンビ化したチャールズに食い殺された。

黒人。ケインの補佐的存在。

T-ウィルスを開発した、車椅子に乗る科学者。避難しきれなかった娘のアンジェラを救うべく、公衆電話を介して密かにアリスたちと交換条件で脱出するための情報を教える。終盤でケインにそのことを知られた上、撃ち殺される。後にゾンビ化し、ケインに襲い掛かり、食い殺した。元々、T-ウイルスは筋ジストロフィーを患った娘のアンジェラの治療のために研究していたものであり、それをアンブレラに奪われたことに後悔と苦悩を抱えていた。原作におけるウィリアム・バーキン博士に近い立ち位置のキャラクターだが、上記のように娘への愛情や道徳心もある。また、アシュフォードという名字だが原作のアシュフォード家とは設定的な関連もほぼ皆無である。

アンブレラ社の科学部門のヘッド。ハイブから脱出したアリスとマットにT-ウイルスを投与し、施術を施して「ネメシス計画」などを始動した張本人である。映画の終盤でラクーンシティ爆破の衝撃で負傷したアリスをアークレイ山地にて救出し、治療して「アリス計画」を始動した。後に公開された、シリーズ6作目にて、本物のアイザックス博士はハイブ内の装置で他のアンブレラ社幹部と共にコールドスリープされており、今作に登場したアイザックス博士はオリジナルの記憶を移植されたクローンの一体であることが判明した。

ハグキおばけ。アンブレラ社の「ネメシス計画（Nemesis Program）」において誕生した強靭な人型生物兵器で、本作のボスクリーチャー。「ネメシス（Nemesis）」とは、ギリシア神話に登場する義憤の女神の名前に由来する。前作『I』の終盤で、リッカーに傷つけられ、T-ウイルスに感染したマット・アディソンが、通常のアンデッド化とは異なる変異を起こしていたことから、アンブレラ社のアイザックス博士とケイン少佐に、T-ウイルスとの適性を見込まれて、ネメシス計画の実験体となった。T-ウイルスとの適合により、T-ウイルス製生物兵器の欠点の一つである知能の低下を克服しており、アンブレラ社から与えられた命令を忠実に遂行し、ロケットランチャーやレールガンを扱うことができる程度の知性を有する。ネメシスの視界はヘッドアップディスプレイのように様々な情報が逐一表示されており、視界に入った人間の武装状態を認識し、脅威であれば排除を行う。アンブレラ社の衛星システムを介して命令を受け取り、受け取った命令はネメシスの視界に文字として表示される。映画劇中でラクーンシティ警察の特殊部隊S.T.A.R.S.が籠城する建物の前に登場した際には、ネメシス計画を遂行するアンブレラ社のケイン少佐から「KILL S.T.A.R.S. MEMBERS（S.T.A.R.S.メンバーを殺せ）」という命令を受け取り、手にしていたロケットランチャーとレールガンを使って、瞬く間にS.T.A.R.S.隊員たちを抹殺した。S.T.A.R.S.隊員と一緒に隠れていたL.J.に関しては、愛銃を放棄して武装を解除したため「危険度ゼロ」と判断して攻撃しなかった。ネメシスと同様に、アイザックス博士からT-ウイルスを投与され、施術を受けたアリスとは、兄妹のような存在で、施術中に取ったデータ上では、アリスとネメシスの強さは互角であったとケイン少佐は語っている。アリスとネメシスが初めて邂逅した際には、ネメシス計画が完全始動し、どちらがT-ウイルスと完全適合して進化を遂げたかを見極めるために、ネメシスにアリスと戦うように命令を下し、ネメシスは執拗にアリスを追跡するようになった。アリスたちがラクーンシティからの脱出を果たすために、市庁舎にやってきた際、ケイン少佐は、アリスの仲間のジルたちを拘束し、アリスとネメシスの一騎打ちとなるよう舞台を整えた。戦いの中でネメシスよりもアリスのほうが肉体的な変異を起こさずに、優れた能力を次々と発揮したことで、ケイン少佐はネメシスを見限り、「ネメシスは進化の袋小路に入ってしまった」とばっさり切り捨てたが、この発言により、ネメシスはマットとしての自我に目覚め、アンブレラ社を裏切ってアリスたちの味方に付いた。その後はアンブレラの隊員たちに攻撃を行っていたが、最後は自身が放ったロケットランチャーの直撃によって墜落してきたヘリの下敷きになり死亡した。原作ゲームシリーズでは、T-ウイルス研究の集大成として生まれたB.O.W.「タイラント」を素体として、「NE-α」と呼ばれる寄生生物を寄生させることで誕生した、タイラントを超える最強の生物兵器であり、原作における正式名称は「ネメシス-T型」であったが、本作ではタイラントを素体にした設定や「NE-α」を寄生させた設定などは無く、単に「ネメシス」と呼称される。原作ゲーム『3』で使用する武器はロケットランチャーのみだったが、本作ではさらにレールガンを用いる。書籍「BIOHAZARD CASE RECORDS 映画『バイオハザード』全記録」内の本作の武器の制作を担当したチャールズ・テイラーの解説によると、劇中でネメシスが使用したレールガンは、軍用ヘリコプターに搭載されるM134ミニガンを改良した物であり、銃身を36㎝まで短くすると同時に、銃口にマズルブレーキを追加して、弾丸を発射する際に燃える火薬がプラズマ効果を発揮するように設計したと解説されている。なお、映画公開後の2012年に発売されたゲーム作品『バイオハザード オペレーション・ラクーンシティ』に登場するネメシスには、レールガンを用いる設定と、ネメシスの視界がヘッドアップディスプレイのように様々な情報が逐一表示されるという映画独自の設定が、ゲームに逆輸入される形で踏襲されている。映画劇中でのビジュアルは、原作ゲーム『3』における「ネメシス-T型 第一形態」のデザインが忠実に再現されているが、原作では白濁した瞳をしていたのに対し、映画では青色の瞳となっている点が異なっている。これは素体となったマットの瞳がそのまま残されているためであり、ネメシスの正体がマットであることにアリスが気が付くきっかけになった。

ラクーンシティの中央入口である。序盤でTウイルス感染者の検問を行っていた。

アンブレラ社がアリスの体内にTウイルスを投与し続け細胞レベルで取り込ませる実験を行った。

アンブレラ社がTウイルスに感染したマットを使って強靭な人型生物兵器の実験を行った。今までのTウイルス感染生物と違い強靭的な身体能力に加えアンブレラ社によるコントロールも可能。